Początek, czyli zapłodnienie!

Zapłodnienie jest złożonym, wieloetapowym procesem, który rozpoczyna się od dotarcia zwycięskiego plemnika do komórki jajowej, a kończy się połączeniem gamet i wymieszaniem chromosomów matczynych z ojcowskimi.

W warunkach fizjologicznych proces zapłodnienia trwa około 24 godzin i zachodzi w bańce jajowodu. Zapłodnienie poprzedzone jest procesem zaplemnienia – w czasie aktu płciowego ejakulat zawierający plemniki zostaje złożony w sklepieniu pochwy w bliskiej okolicy ujścia zewnętrznego kanału szyjki macicy. Dynamiczne ruchy witek pozwalają plemnikom mniej więcej w ciągu godziny pokonać drogę do komórki jajowej. Z puli kilkunastu / kilkudziesięciu milionów plemników do celu dociera jedynie kilka tysięcy z nich, około dwustu uczestniczy w zapłodnieniu, a jedynie jeden może połączyć się z oocytem I rzędu.

W warunkach fizjologicznych zanim plemnik wejdzie w bezpośredni kontakt z komórką jajową, napotyka przeszkodę – grubą warstwę komórek pęcherzykowych; otaczają one oocyt dzięki bogatej w kwas hialuronowy łączącej je substancji pozakomórkowej. By doszło do zapłodnienia, plemnik musi pokonać tę barierę.
Białko powierzchniowe błony komórkowej plemnika wykazuje aktywność hialuronidazy – enzymu rozpuszczającego kwas hialuronowy – dzięki temu plemnik może przedostać się przez warstwę komórek pęcherzykowych i wejść w kontakt z osłonką przejrzystą komórki jajowej. Plemniki wiążą się z osłonką przejrzystą przez specyficzny receptor (rolę receptora dla plemników odgrywają białka osłonkowe ZP2 i ZP3). Reakcja wiązania plemnika z białkiem ZP3 wyzwala reakcję akrosomalną, która polega na tworzeniu się porów w błonie akrosomalnej – akrosom plemnika uwalnia liczne enzymy, które umożliwiają męskiej gamecie przedostanie się przez osłonkę przejrzystą do wnętrza (cytoplazmy) oocytu.
Wniknięcie plemnika do przestrzeni okołożółtkowej i bezpośredni kontakt z błoną komórkową oocytu stymuluje fuzję obydwu gamet. W czasie zapłodnienia indukowane przez plemnik oscylacyjne zmiany stężenia wolnych jonów wapnia [Ca²⁺] w cytoplazmie komórki jajowej są czynnikiem bezpośrednio odpowiedzialnym za aktywację procesów rozwojowych.

Wnikający do komórki jajowej plemnik zapoczątkowuje reakcję kortykalną mającą podstawowe znaczenie w zachowaniu diploidii organizmów – powoduje zahamowanie penetracji przez kolejne plemniki. Ziarnistości kortykalne zgromadzone wokół błony komórkowej zostają uwolnione do przestrzeni okołożółtkowej i na drodze enzymatycznej zmieniają właściwości osłonki przejrzystej, czyniąc ją niepenetrowalną przez plemniki. Opóźniona lub niekompletna reakcja kortykalna powoduje najczęstszy błąd w zapłodnieniu – zapłodnienie polispermiczne (wniknięcie więcej niż jednego plemnika do wnętrza komórki jajowej). Fuzja błon komórkowych umożliwia wniknięcie do cytoplazmy oocytu II rzędu główki plemnika, mitochondriów wstawki i centrioli – większa część witki pozostaje w przestrzeni okołożółtkowej i następnie obumiera. 

W cytoplazmie oocytu rozpoczyna się proces stopniowego przekształcania jądra plemnika w przedjądrze męskie. Jednocześnie dochodzi do przekształcania płytki metafazalnej oocytu (inaczej zwanej wrzecionem kariokinetycznym – tu znajduje się materiał genetyczny w postaci chromosomów pochodzących od matki) w przedjądrze żeńskie (ukończony zostaje drugi podział mejotyczny[1] w oocycie II rzędu).  Przedjądrza są widoczne w komórce jajowej przed fuzją materiału genetycznego, ok. 12 – 22 godzin po zapłodnieniu. Obydwa przedjądrza rozpoczynają syntezę DNA, a po jego replikacji wędrują ku środkowi komórki jajowej. Osłonki otaczające przedjądrza zanikają i formuje się jądro zygotyczne.
W wyniku procesu zapłodnienia dochodzi do odtworzenia diploidalnej (podwójnej) liczby chromosomów, określenia płci przez chromosom pochodzący z plemnika (X lub Y) i zapoczątkowania serii mitotycznych[2] podziałów komórkowych, zwanych bruzdkowaniem.
***

W przypadku procedur zapłodnienia pozaustrojowego pobrane podczas punkcji jajników komórki jajowe mogą zostać zapłodnione przez embriologa w dwojaki sposób – w wyniku klasycznego zapłodnienia pozaustrojowego (IVF, ang. in vitro fertilization) (gdy parametry nasienia są dobre) lub poprzez wprowadzenie plemnika do wnętrza oocytu – mikroiniekcja plemnika do wnętrza komórki jajowej (ICSI, ang. intracytoplasmic sperm injection).

Pierwsza z tych technik wspomaganego rozrodu (IVF) nie wymaga oczyszczenia komórek jajowych z otaczających ją komórek wieńca promienistego – oocyty umieszcza się grupami w kroplach medium hodowlanego, a następnie dodaje się wcześniej wypreparowane nasienie o koncentracji ok. 100 000 plemników / ml. Szalkę z tak zainseminowanymi oocytami umieszcza się w inkubatorze, który naśladuje warunki panujące w macicy. Do zapłodnienia dochodzi samoistnie – jeden z plemników wnika do wnętrza komórki jajowej.

W przypadku ICSI warunkiem koniecznym jego przeprowadzenia jest usunięcie komórek wieńca promienistego otaczających oocyt na drodze enzymatycznej i mechanicznej – embriolog w roztworze hialuroidazy sprawnie rozprasza komórki wieńca promienistego poprzez kilkukrotną aspirację do pipet o zmniejszających się średnicach wewnętrznych kapilar. Enzymatyczne i mechaniczne usunięcie warstwy komórek ziarnistych daje okazję do oceny morfologii oocytów przed ich zapłodnieniem w warunkach in vitro, zwłaszcza do oceny dojrzałości jądrowej oocytu. Przyjmuje się, że oocyt, który osiągnął dojrzałość jądrową posiada pierwsze ciałko kierunkowe w przestrzeni okołożółtkowej. Tak wyselekcjonowane oocyty są przez embriologa poddawane zapłodnieniu – pod dużym powiększeniem optycznym (400x) mikroskopu do wnętrza komórek jajowych za pomocą cienkiej igły wprowadzane są pojedyncze plemniki. Szalka z zapłodnionymi oocytami, podobnie jak w przypadku klasycznego IVF-u, jest umieszczana z inkubatorze hodowlanym.

Następnego dnia po zapłodnieniu, również z wykorzystaniem mikroskopu, embriolog ocenia prawidłowość przebiegu procesu zapłodnienia – za prawidłowo zapłodnione uznaje się oocyty z dwoma przedjądrzami i dwoma ciałkami kierunkowymi. Obecność większej niż dwa liczby przedjądrzy świadczy o tym, że komórka zapłodniła się nieprawidłowo. Cechy zapłodnienia (obecność przedjądrzy) są możliwe do zaobserwowania jedynie przez krótki czas (17+/-1godzina po zapłodnieniu) – niekiedy komórki w chwili porannej oceny mikroskopowej nie pokazują jeszcze / już cech zapłodnienia; czasem możliwe jest tzw. milczące zapłodnienie (silent fertilization), którego nie można zaobserwować pod mikroskopem, mimo że do niego doszło. Wówczas komórki takie są obserwowane w kolejnych dniach (do 3. doby po zapłodnieniu) i możliwe jest, że w tym okresie podejmą podziały i zostaną uznane za prawidłowe zarodki, warunkiem jest obecność dwóch ciałek kierunkowych. Niekiedy (w pon.5% przypadków) komórki poddawane zapłodnieniu w warunkach in vitro degenerują (obumierają), nie ma więc szans na podjęcie przez nie prawidłowych podziałów zarodkowych.